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Title: Aplicação da citometria de fluxo no estudo da resposta imune de pacientes com Leishmaniose tegumentar americana
Authors: Pereira, Allana Maria de Souza
metadata.dc.contributor.authorLattes: http://lattes.cnpq.br/0605182920865262
metadata.dc.contributor.advisor: Hernandes, Valéria Pereira
metadata.dc.contributor.advisorLattes: http://lattes.cnpq.br/9260270756078209
metadata.dc.contributor.advisor-co: Oliveira, Beatriz Coutinho de
metadata.dc.contributor.advisor-coLattes: http://lattes.cnpq.br/1971181834355538
Keywords: Diagnóstico;Imunologia;Leishmania braziliensis
Issue Date: 2019
Citation: PEREIRA,Allana Maria de Souza. Potencial Aplicação da citometria de fluxo no estudo da resposta imune de pacientes com Leishmaniose tegumentar americana. 2019. 63 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2019.
Abstract: The American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an infectious, non-contagious disease with an average of 1.3 million annual cases. Brazil shows the highest prevalence in number of reported cases in the Americas, where the specific agent is the species L. (V.) braziliensis. The diagnosis is commonly performed by an association of clinical, epidemiological and laboratorial tests. The immunological approaches which are most commonly used in the routine are the indirect immunofluorescence (IFI) and the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), however, they may present limitations. Therefore, alternative methods have been studied, and one of them is flow cytometry (FC). Thus, the aim of this work is to evaluate, by flow cytometry, the role of the humoral response in the development of cutaneous lesions of patients with the active disease before treatment (BT), and in those healed after therapeutic intervention (PT). Sera samples were inactivated. For the FC assays, promastigote forms of L. (V.) braziliensis obtained by the reference strain were expanded in Schneider’s medium until they reached exponential phase. After washing protocols, the concentration of the parasites was adjusted and they were fixed with 1% paraphormaldehyde. For the IFI and ELISA assays, the total antigen of L. (V.) braziliensis were used. In FC and IFI assays, the IgG antibody was conjugated to a fluorophore and in ELISA, to an enzyme. Regarding IFI results, from the evaluated sera, 92.85% (13/14) were positive on BT group, 61.54% (8/13) were positive 1 year PT, 70% (7/10) 2 years PT and 50% (5/10) 5 years PT were positive. In ELISA, 92.8% (13/14) of BT patients were positive; and 53.8% (7/13) 1 year PT, 88.8% (8/9) 2 years PT and 100% (5/5) 5 years PT (5/5) remained positive for ATL. In FC, 86% (12/14) of BT patients were positive and 77% (10/13), 80% (8/10) and 70% (7/10) of the patients 1, 2 and 5 PT, respectively, were negative for the assay. Based on the ROC curves analysis to compare the performance of the 3 tests, it was observed that the area under the curve (AUC) of IFI (AUC=0.879; IC95%= 0.754-0.954) was lower that FC’s (AUC= 0.890; IC95%=0.767-0.961), meaning it had a lower performance. Comparing ELISA and FC, it was observed that the AUC of ELISA (AUC=0.808; IC95%= 0.652-0.915) has differed from the one observed for FC (AUC= 0.896; IC95%= 0.758-0.970), where again, FC has shown a superior performance. As for the results of the IgG isotypes’ (IgG1, IgG2 and IgG3) standardization, it was observed that the best dilution for IgG1 was 1:400; for IgG2, 1:100; and for IgG3, 1:200. On the analysis to verify IgG1 applicability, it was seen that BT 63.2% of the patients were positive, and 1PT, 17.7%; 2PT, 72.8% and 5PT, 12.55% of the patients were positive. Therefore, we believe that FC can be used as a diagnostic tool for ATL since it is positive in the presence of the disease, being superior to the two conventional methods used in the laboratory routine. Also, the use of the IgG1 isotype has the ability to contribute as a more sensitive and specific diagnostic method when compared to the classical ones.
Description: A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa, não contagiosa, com média de 1,3 milhões de casos anuais. O Brasil apresenta a maior prevalência em notificações nas Américas e o agente específico é a espécie L. [V.] braziliensis. O diagnóstico é comumente realizado por uma associação de fatores clínicos, epidemiológicos e testes laboratoriais. As técnicas de abordagens imunológicas mais utilizadas na rotina laboratorial são a reação de imunofluorescência indireta (IFI) e o ensaio imunoenzimático (ELISA), porém, podem apresentar limitações. Com isso, abordagens imunológicas alternativas vêm sendo estudadas, e uma delas é a citometria de fluxo (CF). Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar através da citometria de fluxo, a participação da resposta imune humoral no desenvolvimento de lesões cutâneas em indivíduos com a doença ativa antes do tratamento (AT), e naqueles curados após o tratamento (PT). As amostras de soro utilizadas para os testes foram inativadas. Para os ensaios de CF formas promastigotas de L. (V.) braziliensis obtidas a partir da cepa de referência, foram expandidas em meio Schneider´s até atingirem a fase exponencial. Após etapas de lavagem, a concentração de parasitos foi ajustada e fixada no paraformaldeído a 1%. Para os ensaios de IFI e ELISA foram utilizados os antígenos totais da L. (V.) braziliensis. Para a CF e a IFI o anticorpo foi conjugado a um fluorocromo e no ELISA a uma enzima. Como resultados dos ensaios de IFI, dos soros avaliados, 92,85% (13/14) foram positivos AT, 61,54% (8/13) um ano, 70% (7/10) dois anos e 50% (5/10) cinco anos PT foram positivos. No teste de ELISA, 92,8% (13/14) dos pacientes AT foram positivos; e 53,8% (7/13) um ano PT, 88,8% (8/9) dois anos PT e 100% (5/5) cinco anos PT (5/5) continuaram com título positivo para LTA. Para a CF, foram identificados como positivos 86% (12/14) dos pacientes AT e 77% (10/13), 80% (8/10) e 70% (7/10) dos indivíduos, respectivamente, um, dois e cinco anos PT foram negativos para o ensaio de CF. Com a análise das curvas ROC comparando a performance dos três testes, observou-se que área sob a curva (ASC) da IFI (ASC=0,879; IC95%= 0,754-0,954) foi menor do que o teste de citometria de fluxo (ASC= 0,890; IC95%=0,767-0,961), compreendendo um desempenho menor em relação à citometria. Para comparação entre o ELISA e a CF se observou que área sob a curva (ASC) do ELISA (ASC=0,808; IC95%= 0,652-0,915) diferiu da observada para o teste de CF (ASC= 0,896; IC95%= 0,758-0,970), onde novamente a CF apresentou um desempenho superior. Com os resultados obtidos da padronização dos isotipos IgG1, IgG2 e IgG3, pôde se observar que a melhor diluição do isotipo IgG1 foi a diluição 1:400, para o isotipo IgG2, 1:100 e para o isotipo IgG3, 1:200. Na análise da aplicabilidade do isotipo IgG1, foi constatado que AT, 63,2% dos pacientes foram positivos e para os pacientes 1PT, 17,7%; 2PT, 72,8% e 5PT, 12,55% se apresentaram positivos. Dessa forma acredita-se que citometria de fluxo aplica-se ao diagnóstico da LTA por apresentar resultados positivos na presença da doença, sendo superior aos dois testes utilizados na rotina laboratorial para LTA e que a utilização do isotipo IgG1 tem amplas possibilidades para contribuir como um método de diagnóstico mais sensível e específico do que os métodos tradicionais.
URI: http://hdl.handle.net/123456789/884
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