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https://repository.ufrpe.br/handle/123456789/3806
Title: | Análise da Influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC |
Authors: | Oliveira, Michelly Maria Pereira e |
metadata.dc.contributor.authorLattes: | http://lattes.cnpq.br/4153747599532886 |
metadata.dc.contributor.advisor: | Almeida, Anna Carolina Soares |
Keywords: | Enterobactérias;Expressão gênica;Resistência genética;Agentes antiinfecciosos |
Issue Date: | 5-Mar-2021 |
Citation: | OLIVEIRA, Michelly Maria Pereira e. Análise da Influência do número de cópias na expressão do gene blaKPC. 2021. 22 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biológicas) - Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2021. |
Abstract: | Enterobacteria has stood out in clinical practice by detecting enzymatic mechanisms that confer resistance to antimicrobials, especially Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) due to its rapid worldwide dissemination caused by the location of the blaKPC gene in large transferable plasmids and transposons. The expression of the blaKPC gene can be affected by intrinsic characteristics of the host that hosts it or the number of copies. An unusual phenotype was observed in clinical isolates of P. stuartii and M. morganii and their respective transformants, where E. coli cells that received plasmids that carried the blaKPC gene, showed MIC values, for some beta- lactams, higher than in clinical isolates. The objective of this work was to analyze the number of copies of the blaKPC gene, relating them to their respective MICs. The genomic DNA of the bacterial isolates was extracted from the PromegaTM WizardTM Genomic DNA Purification kit according to the manufacturer's guidelines, and was then quantified by spectrophotometry using the NanoDropTM Lite equipment from Thermo Fisher Scientific. The endogenous control genes were chosen from the literature after a robust search, after which they were analyzed in silico. Using databases, software and other tools, primers were designed. To carry out absolute quantification, an estimate was made based on a proportion of the relative quantitative relationship between target and endogenous control, using the formula 2-ΔCq. For the experiments, the SteponeTM Real-time PCR System (Applied Biosystems) and the SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems) were used. The designed primers underwent a validation step to evaluate their efficiency (tufMm - 93,019, tufPs - 90,228 and tufKp - 103,474, both with R2 close to 1). The data generated by the absolute qPCR experiments were associated with the different phenotypic profiles observed and from the tests it was determined that the number of copies of the blaKPC gene for transforming isolates and clinical isolates does not vary significantly, pointing out that another mechanism must be interfering in the expression of the blaKPC gene, directly influencing resistance levels. |
Description: | As enterobactérias tem se destacado na prática clínica pela detecção de mecanismos enzimáticos que conferem resistência a antimicrobianos, destacando-se a Klebsiella pneumoniae carbapenemase (KPC) devido a sua rápida disseminação mundial ocasionada pela localização do gene blaKPC em grandes plasmídios transferíveis e transposons. A expressão do gene blaKPC pode ser afetadas por características intrínsecas do hospedeiro que o abriga ou número de cópias. Um fenótipo não usual foi observado em isolados clínicos de P. stuartii e M. morganii e seus respectivos transformantes, onde as células de E. coli receptoras de plasmídeos que carregavam o gene blaKPC, apresentaram valores de CIMs, para alguns beta-lactâmicos, maiores do que nos isolados clínicos. O objetivo deste trabalho foi analisar o número de cópias do gene blaKPC, relacionando-os com seus os respectivos CIMs. O DNA genômico dos isolados bacterianos foi extraído a partir do kit PromegaTM WizardTM Genomic DNA Purification conforme orientações do fabricante, e em seguida, foi quantificado por espectofotometria através do equipamento NanoDropTM Lite da Thermo Fisher Scientific. Os genes de controle endógenos foram escolhidos a partir da literatura depois de uma busca robusta, em seguida foram analisados in silico. Utilizando bancos de dados, softwares e outras ferramentas, os primers foram desenhados. Para a realização da quantificação absoluta, foi realizada uma estimativa baseada em uma proporção da relação quantitativa relativa entre alvo e o controle endógeno, utilizando a fórmula 2-ΔCq. Para os experimentos foi utilizando o equipamento SteponeTM Real-time PCR System (Applied Biosystems) e o corante SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems). Os primers desenhados passaram por uma etapa de validação visando avaliar sua eficiência (tufMm - 93.019, tufPs - 90.228 e tufKp - 103.474, ambos com R2próximos de 1). Os dados gerados pelos experimentos de qPCR absoluta foram associados com os distintos perfis fenotípicos observados e a partir dos ensaios foi determinado que o número de cópias do gene blaKPC para os isolados transformantes e para os isolados clínicos não variam significativamente, apontando que outro mecanismo deve estar interferindo na expressão do gene blaKPC, influenciando diretamente os níveis de resistência. |
URI: | https://repository.ufrpe.br/handle/123456789/3806 |
Appears in Collections: | TCC - Bacharelado em Ciências Biológicas (Sede) |
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