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Title: Produção, extração, purificação e caracterização de proteases fibrinolíticas produzidas por Streptomyces parvulus DPUA 1573
Authors: Nascimento, Maria Clara do
metadata.dc.contributor.authorLattes: http://lattes.cnpq.br/5929405825655717
metadata.dc.contributor.advisor: Bezerra, Raquel Pedrosa
metadata.dc.contributor.advisorLattes: http://lattes.cnpq.br/1466206759539320
metadata.dc.contributor.advisor-co: Batista, Juanize Matias da Silva
metadata.dc.contributor.advisor-coLattes: http://lattes.cnpq.br/6699725036732885
Keywords: Biotecnologia;Enzimas proteolíticas;Trombose;Bactérias
Issue Date: 29-Nov-2021
Citation: NASCIMENTO, Maria Clara do. Produção, extração, purificação e caracterização de proteases fibrinolíticas produzidas por Streptomyces parvulus DPUA 1573. 2021. 68 f. Trabalho de Conclusão de Curso (Bacharelado em Ciências Biológicas) – Departamento de Biologia, Universidade Federal Rural de Pernambuco, Recife, 2021.
Abstract: Due to their fibrin degradation potential, fibrinolytic proteases are a promising alternative in the pharmaceutical industry for the treatment of cardiovascular diseases, especially thrombosis. There are several sources of fibrinolytic proteases, however, the microbial sources are the ones that stand out in terms of low cost and high production rates. From their production to application, enzymes need to go through several processes, which sounds negative, making the steps more costly and late. A method capable of overcoming these problems is the aqueous two-phase system (SDFA), a process capable of reducing downstream steps. The objective of this work was to produce, purify and biochemically characterize the fibrinolytic protease produced by Streptomyces parvulus DPUA 1573. The protease was produced by submerged fermentation using agro-industrial waste or co-products. The crude extract that showed the highest enzymatic activity (passion fruit peel flour) was subjected to extraction by SDFA consisting of polyethylene glycol (PEG) and phosphate salts (potassium and sodium), following a 24 plan. After extraction by SDFA, the protease was subjected to purification by gel filtration chromatography, and already purified had its biochemical characterization performed. The protease produced by S. parvulus DPUA 1573 showed fibrinolytic activity of 15.46 U/mL and was able to form a halo of 317.31 mm2 acting on fibrin degradation. In SDFA, the fibrinolytic protease partitioned preferentially to the PEG-rich phase. The best assay selected according to the combination of the highest specific activity index, purification factor and activity yield was 16, composed of PEG 8,000 gmol-1, 17.5 v/v PEG, pH 8.0 and 15 v/v of phosphate salts. The protease activity of the enzyme was highly stimulated in the presence of iron, reaching a 55% increase in activity, and drastically decreased in the presence of the protease inhibitor 2-mercaptoethanol (91%). The optimum temperature and pH for the enzymatic activity were 40ºC and pH 7.0, respectively, keeping the enzyme activity stable between 30ºC and 60ºC and in the pH range from 7.0 to 8.5. Based on the analyzed results, it was seen that S. parvulus DPUA 1573 proved to be a good producer of fibrinolytic proteases, and the PEG/Phosphate aqueous two-phase system proved to be a great alternative for the extraction and pre-purification of fibrinolytic proteases.
Description: Devido ao seu potencial de degradação da fibrina, as proteases fibrinolíticas são uma alternativa promissora na indústria farmacêutica para o tratamento de doenças cardiovasculares, especialmente a trombose. Diversas são as fontes de proteases fibrinolíticas, porém, as fontes microbianas são as que mais se destacam em termos de baixo custo e altos índices de produção. Desde a sua produção até aplicação as enzimas precisam passar por diversos processos, o que soa negativo tornando as etapas mais custosas e tardias. Um método capaz de superar essas problemáticas é o sistema de duas fases aquosas (SDFA), processo capaz de diminuir as etapas do downstream. O objetivo deste trabalho foi produzir, purificar e caracterizar bioquimicamente a protease fibrinolítica produzida por Streptomyces parvulus DPUA 1573. A protease foi produzida por fermentação submersa utilizando resíduos ou coprodutos agroindustriais. O extrato bruto que apresentou a maior atividade enzimática (farinha da casca de maracujá) foi submetido a extração por SDFA constituído por polietilenoglicol (PEG) e sais de fosfato (potássio e sódio), seguindo um planejamento 24. Após a extração por SDFA, a protease foi submetida a purificação por cromatografia em gel filtração, e já purificada teve sua caracterização bioquímica realizada. A protease produzida por S. parvulus DPUA 1573 demonstrou atividade fibrinolítica de 15.46 U/mL e foi capaz de formar um halo de 317.31 mm2 agindo na degradação da fibrina. No SDFA, a protease fibrinolítica particionou preferencialmente para a fase rica em PEG. O melhor ensaio selecionado de acordo com a combinação do maior índice de atividade específica, fator de purificação e rendimento na atividade foi o 16, composto por PEG 8.000 gmol-1, 17,5 v/v de PEG, pH 8,0 e 15 v/v de sais de fosfato. A atividade proteásica da enzima foi muito estimulada na presença do ferro, chegando a um aumento de 55% na atividade, e drasticamente diminuída diante o inibidor de proteases 2-mercaptoethanol (91%). A temperatura e o pH ótimo para a atividade enzimática foram 40ºC e pH 7,0, respectivamente, se mantendo a atividade da enzima estável entre 30ºC e 60ºC e na faixa de pH de 7.0 a 8.5. Diante dos resultados analisados foi visto que, S. parvulus DPUA 1573 se mostrou uma boa produtora de proteases fibrinolíticas, e o sistema de duas fases aquosas PEG/Fosfato se mostrou uma ótima alternativa para a extração e pré-purificação de proteases fibrinolíticas.
URI: https://repository.ufrpe.br/handle/123456789/3096
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